Das Fort Asunción wurde am 15. August 1537 von Juan de Salazar de Espinoza de los Monteros (auch: y Espinoza) auf Geheiß von Pedro de Mendoza gegründet. Am 16. September 1541 wird der städtische Status anerkannt.

Asunción ist eine der ältesten spanischen Städte Südamerikas. Der Ort wurde vermutlich von Juan de Ayolas zum ersten Mal besucht. Gründungsname ist La muy noble y leal ciudad de Nuestra Señora Santa María de la Asunción („Die sehr ehrwürdige und (spanien-)treue Stadt Unserer Heiligen Frau Maria der Himmelfahrt“, gemeint ist Mariä Himmelfahrt). Dieser Name ist bis heute der offizielle Name Asuncións.

Asunción wird als „Madre de Ciudades“ („Städtemutter“) bezeichnet. Dies rührt daher, dass im 16. und 17. Jahrhundert von Asunción ausgehend, etliche Expeditionen und Städtegründungen durchgeführt wurden. Als Beispiel sei die zweite Gründung der heutigen argentinischen Hauptstadt Buenos Aires genannt.

1731 gab es unter der Leitung des Uruguayers José de Antequera y Castro den ersten Aufstand unter der spanischen Kolonialherrschaft. Diese wird als „Revolución de los comuneros“ bezeichnet. (Nicht zu verwechseln mit dem gleichnamigen spanischen Aufstand der Comuneros).

Paraguay erlangte seine Unabhängigkeit von der spanischen Krone am 15. Mai 1811. Kurze Zeit danach, während der Diktatur José Gaspar Rodríguez de Francias, wird das ursprüngliche Stadtzentrum dem Erdboden gleichgemacht. Die Neubebauung wurde im kolonialtypischen Schachbrettmuster angelegt.

Während des Tripel-Allianz-Krieges (1865–1870) wurde Asunción von Brasilien besetzt. Die Besatzung dauerte bis 1876 an. Der Handelsverkehr, der seit der Freigabe der Schifffahrt auf dem Fluss Paraguay im Jahr 1858 einen bedeutenden Aufschwung genommen hatte, wurde durch die Kriegsunruhen empfindlich gestört.

Im Jahr 1884 verzeichnete Asunción 20.000 Einwohner, die mit Leder, Tabak, Zucker, Maniok, Erdnüssen, Rum und Mate („Paraguaytee“), handelten.

Ende des 19. Jahrhunderts wurde Asunción vermehrt von europäischen Auswanderern (vorrangig Spaniern, Italienern und Deutschen) besiedelt. Zu Beginn des 20. Jahrhundert registrierte es eine zweite Einwanderungswelle aus Vorderasien (besonders Türkei, Syrien und Libanon).

1927 forderte ein Wirbelsturm 300 Todesopfer.

Am 1. August 2004 brannte nach einer Gasexplosion ein Einkaufszentrum der Ycua Bolaños Gruppe (benannt nach der Felsquelle in Caazapá) nieder. Bei dem Brand wurden 464 Menschen getötet und über 500 verletzt.